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• 實(shí)驗(yàn)室設(shè)施

開展無菌檢查及微生物限度檢查工作，首先要按照《藥品檢驗(yàn)所實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理規(guī)范》及《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》的要求，建立一個(gè)布局合理、使用方便、操作安全的無菌室，并且配有完善的實(shí)驗(yàn)設(shè)施和管理制度。無菌檢查、微生物限度檢查以及接種室（接種對照菌、菌種傳代）均應(yīng)嚴(yán)格分開，具有危險(xiǎn)性的毒株、毒素如破傷風(fēng)梭菌、黃曲霉毒素的實(shí)驗(yàn)室需單獨(dú)使用，以便控制防止傳播。

• 潔凈實(shí)驗(yàn)室

1.潔凈室的布局

1.1根據(jù)樣品檢驗(yàn)要求，一般應(yīng)至少包括更衣緩沖系統(tǒng)、微生物限度檢查室、無菌檢查室、陽性菌室和物流通道。

1.2更衣系統(tǒng)應(yīng)至少包括一更（含更鞋）、二更（含洗手）、緩沖以及人流走廊等。

1.3物流通道應(yīng)考慮凈污分流的布局，有條件的可設(shè)置污物走廊

2.潔凈室的設(shè)計(jì)要求

2.1凈化級(jí)別：潔凈走廊、檢查室、陽性菌室應(yīng)為一萬級(jí)；其他房間應(yīng)為十萬級(jí)

2.2氣流組織：陽性菌室對走廊呈負(fù)壓，走廊對緩沖有5Pa的正壓；陽性菌室全排風(fēng)

2.3電氣控制：控制開關(guān)外置；設(shè)置通訊系統(tǒng)

3.結(jié)構(gòu)與要求：

無菌潔凈室不宜設(shè)在底層，防潮、防霉、采光好，遠(yuǎn)離交通干道，廁所及污染區(qū)，面積不超過10m2，高度不超過2.4m，由兩個(gè)緩沖間、操作間組成。操作間緩沖間之間應(yīng)有樣品傳遞窗，出入操作間和緩沖間的門不應(yīng)直對。無菌室內(nèi)應(yīng)六面光滑平整，無縫隙，不起灰，不落塵，耐腐蝕，易清洗，墻壁與地面、墻壁與天花板連接處應(yīng)呈凹弧形，操作間不得安裝下水道。
    無菌室內(nèi)的照明燈應(yīng)嵌裝在天花板內(nèi)，采光面積要大，光照應(yīng)分布均勻，光照度不低于300勒克斯。緩沖間和操作間應(yīng)裝有紫外線殺菌燈（2－25w/m3）''用于空氣消毒。紫外線波長200－300nm者具有殺菌作用，其中以265－266nm殺菌作用最強(qiáng)，這與DNA的吸收光譜范圍一致，其殺菌機(jī)理可能是在細(xì)菌細(xì)胞DNA中引起胸腺嘧啶雙聚體形成，從而干擾細(xì)菌細(xì)胞DNA復(fù)制，導(dǎo)致細(xì)菌變異死亡。紫外線殺菌燈1m以內(nèi)距離殺菌效果最佳，每次開燈照射時(shí)間為30min。應(yīng)定期檢查紫外線燈輻射強(qiáng)度，不得低于70μW·cm-21m距離。其缺點(diǎn)是穿透力弱，一張紙板可以阻礙光的透過，不能穿透固體物，故只能用作表面消毒及一些不耐熱或化學(xué)消毒劑物品的消毒。

4.溫度、濕度
無菌室內(nèi)溫度和相對濕度直接影響紫外殺菌燈的殺菌效果，故溫度最好控制在25±2℃，相對濕度40－60％。操作間或凈化工作臺(tái)的潔凈空氣應(yīng)保持對環(huán)境形成正壓，不低于49Pa。

5.操作間
無菌室內(nèi)應(yīng)安裝空氣除菌過濾層流裝置及調(diào)溫裝置。潔凈度要求：凈化工作臺(tái)潔凈度為100級(jí)，無菌室應(yīng)為10000級(jí)。
操作間應(yīng)準(zhǔn)備乙醇燈（或煤氣燈），火柴，2％碘酊棉球及75％乙醇棉球、試管架、大小橡皮乳頭、砂輪、記號(hào)筆、無菌剪刀、鑷子、注射器等。微生物限度檢查無菌室操作間內(nèi)還應(yīng)有電子稱（感覺為0.1g，最大稱量為300g為宜），電動(dòng)勻漿儀等。
6.緩沖間
緩沖間內(nèi)應(yīng)有洗手盆，消毒液，無菌衣，帽，口罩，拖鞋等，緩沖間內(nèi)不應(yīng)放置培養(yǎng)箱和其他雜物。

（二）潔凈室的使用

1.在實(shí)驗(yàn)開始之前1小時(shí)啟動(dòng)風(fēng)機(jī)系統(tǒng)（空調(diào)系統(tǒng)），并開啟空氣消毒裝置，消毒至少半小時(shí)后關(guān)閉

2.觀察并確保潔凈室的壓差

3.物品經(jīng)物流通道進(jìn)入潔凈室

4.人員正確著裝后經(jīng)人流通道進(jìn)入潔凈室

5.使用完畢，應(yīng)用消毒液清潔工作臺(tái)面。實(shí)驗(yàn)人員在更衣室換下無菌工作衣后出潔凈工作室。開啟空氣消毒裝置，消毒至少半小時(shí)后，關(guān)閉潔凈工作室的控制開關(guān)。

（三）潔凈室的清潔維護(hù)

1.潔凈室的清潔維護(hù)分為日常維護(hù)、定期維護(hù)和不符合時(shí)的維護(hù)。

2.日常維護(hù)由每次實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)人員進(jìn)行，維護(hù)的范圍為進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的潔凈工作室和輔助潔凈區(qū)，維護(hù)的頻率為每次實(shí)驗(yàn)后。

3.定期維護(hù)由實(shí)驗(yàn)室指定專人進(jìn)行，維護(hù)的范圍為所有潔凈工作室，維護(hù)的頻率為每二周一次。

4.不符合時(shí)的維護(hù)由實(shí)驗(yàn)人員進(jìn)行，維護(hù)的范圍為所有不符合的潔凈室，維護(hù)的時(shí)機(jī)為出現(xiàn)不符合時(shí)

• 潔凈室的驗(yàn)證

1.驗(yàn)證的項(xiàng)目：潔凈度、微生物數(shù)、換氣次數(shù)、靜壓差、照度、溫度、相對濕度

2.驗(yàn)證的技術(shù)要求

3.驗(yàn)證的周期  建議每半年一次，也可根據(jù)潔凈室的使用頻率適當(dāng)增加驗(yàn)證次數(shù)。

4.驗(yàn)證的方法  潔凈度和微生物數(shù)：采用GB/T16292~16294-1996，其他項(xiàng)目：參照J(rèn)GJ71－90。

5.驗(yàn)證不符合項(xiàng)的處理

5.1當(dāng)潔凈度、微生物數(shù)、換氣次數(shù)、靜壓差等指標(biāo)出現(xiàn)不符合時(shí)，應(yīng)停用潔凈室，對凈化系統(tǒng)進(jìn)行調(diào)整后，在重新驗(yàn)證，直至符合規(guī)定才能重新啟用潔凈室。

5.2當(dāng)溫度、相對濕度和照度等指標(biāo)出現(xiàn)不符合時(shí)，潔凈室可不必停用，但應(yīng)及時(shí)修復(fù)空調(diào)系統(tǒng)（或更換照明裝置），使其符合規(guī)定。

二、實(shí)驗(yàn)室管理：
為保證實(shí)驗(yàn)工作有序進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)室必須制定一系列實(shí)驗(yàn)室管理制度。

（一） 實(shí)驗(yàn)室要求：
1實(shí)驗(yàn)室環(huán)境應(yīng)清潔、衛(wèi)生、安靜，實(shí)驗(yàn)室內(nèi)嚴(yán)禁吸煙和飲食。
2實(shí)驗(yàn)人員必須穿戴工作衣帽，工作服經(jīng)常洗滌、消毒、保持清潔。
3操作前后或離開實(shí)驗(yàn)室必須用肥皂或消毒液洗手。
4發(fā)生菌液污染臺(tái)面或地面，應(yīng)立即用3％甲醛或5％碳酸等消毒液由外向內(nèi)傾覆其上，1小時(shí)后再擦拭，如為破傷風(fēng)梭菌，則應(yīng)隔夜后再擦洗。
5工作衣、帽、口罩受到菌液污染時(shí)，應(yīng)立即脫下使污染部位包裹在內(nèi)部，高壓滅菌后再清洗。
6如有傳染性培養(yǎng)物污染手部，應(yīng)先用75％乙醇棉球擦拭，再浸入0.1%新潔爾滅消毒液內(nèi)泡手，然后再用肥皂及清水徹底洗干凈。
7接種環(huán)（針），每次使用前后，必須通過火焰滅菌，冷卻后方可接種培養(yǎng)物，接種帶有蠟質(zhì)、油質(zhì)的培養(yǎng)物或菌苔殘留多時(shí)，不應(yīng)立即在火焰上灼燒，應(yīng)先在內(nèi)焰里將油質(zhì)培養(yǎng)物烘干后再移至火焰上滅菌，以免活菌外濺污染環(huán)境及感染操作者。
8帶菌的吸管應(yīng)浸泡在5％甲酚消毒液內(nèi)24h后取出清洗，帶菌的試管或培養(yǎng)物應(yīng)在121℃高壓滅菌30分鐘后再取出清洗。
9在接種霉菌、放線菌時(shí)應(yīng)在鋪有浸過消毒液的紗布上操作，防止孢子散落傳播。
10廢棄物的處理：

1. 必須消除生物危害后，才能處理，一般使用高壓蒸汽滅菌，也可以采用直接焚燒。
2. 污染性銳器（如一次性針頭）應(yīng)滅菌后處理，注意避免銳器扎傷。
3. 污染性可重復(fù)使用的材料（如平皿）應(yīng)滅菌后清洗，宜使用不易破碎的材料。
4. 工作服（含潔凈工作服）應(yīng)定期清洗，懷疑污染的工作服應(yīng)滅菌后清洗，潔凈工作服應(yīng)滅菌后使用。

（二） 無菌操作要求：
無菌操作是指在無菌的環(huán)境條件下，使用無菌器材，防止微生物污染的操作技術(shù)。即保持待檢樣品在操作時(shí)不被污染，又要防止被檢的微生物及陽性對照菌在操作中污染環(huán)境或感染操作人員。從事無菌及微生物操作的工作人員必須經(jīng)過無菌技術(shù)及基礎(chǔ)微生物學(xué)專業(yè)知識(shí)的學(xué)習(xí)及培訓(xùn)才具備上崗操作的資格，微生物專業(yè)檢驗(yàn)人員也不應(yīng)該頻繁地變換工作崗位。
1.無菌室應(yīng)每次使用前后用0.1%苯扎溴銨溶液或2％甲醛液擦拭工作臺(tái)面及可能污染的死角，濕拖地面，打開無菌空氣過濾器及超凈工作臺(tái)的開關(guān)30分鐘，紫外線殺菌燈照射1小時(shí)。
2.操作人員用肥皂洗手后進(jìn)入緩沖間換拖鞋，用75％乙醇棉球擦手，穿戴工作衣帽、口罩。將所需物品剝?nèi)ヅＦぜ埣巴獍b，從傳遞窗移入操作間，再用0.1%苯扎溴銨溶液泡手后進(jìn)入操作間，在乙醇（或煤氣燈）火焰區(qū)（火焰高度3－5cm）操作。
3供試品表面消毒，如為安瓿先用砂輪劃痕后用2％碘酒棉球擦拭，再用75％乙醇棉球擦拭、待干，也可以用消毒液浸泡消毒。
4操作者勿用嘴直接吸吹吸管，防止致病菌感染操作人員及口中的雜菌污染供試品。
5在無菌操作中切勿大幅度或快速動(dòng)作、拖行，以免攪動(dòng)空氣中塵埃微粒。
6注射器如需回抽時(shí)，應(yīng)對著火焰吸入無菌空氣。
7所用的器材如培養(yǎng)基、稀釋劑配制后經(jīng)濕熱滅菌121℃30分鐘，吸管培養(yǎng)皿等均應(yīng)洗滌，干燥，包扎后經(jīng)干熱滅菌160℃2小時(shí)才能使用。

三、消毒劑的質(zhì)量控制 

（一）消毒劑安全使用原則

1.正確選擇消毒劑的種類，盡可能選擇低毒、低殘留的消毒劑。

2.正確選擇使用濃度，確保消毒效果。

3.正確選擇消毒方式，可以浸泡、擦拭或噴霧。

4嚴(yán)格掌握消毒時(shí)間。

5.定期更換，避免產(chǎn)生耐藥性。

6.不聯(lián)用和混合使用。

7消毒前，應(yīng)進(jìn)行清潔。

（二）消毒劑的種類 

1.高效消毒劑（HLD）：能殺滅一切微生物（包括芽孢），常見的有過氧乙酸、甲醛、環(huán)氧乙烷和含氯消毒劑

2.中效消毒劑（ILD）：能殺滅抵抗力較強(qiáng)的結(jié)核桿菌和其他細(xì)菌、真菌和大多數(shù)病毒，常見的有乙醇、苯扎溴銨、碘酊和甲酚皂溶液等

3.低效消毒劑（LLD）：能殺滅除結(jié)核桿菌以外的抵抗力較弱的細(xì)菌以及抵抗力較弱的真菌（如念珠菌）和病毒（如流感病毒、艾滋病毒等），常見的有氯已定、三氯散和高錳酸鉀等

• 消毒劑配制

1.根據(jù)消毒劑使用區(qū)域和對象的不同，將消毒劑分成3類，分別是：

第一類消毒劑，專用于普通實(shí)驗(yàn)區(qū)，僅用于物品外表面的消毒，常用的有聚維酮碘和石炭酸等；

第二類消毒劑，專用于潔凈室的更衣室，僅用于佩戴手套的雙手消毒，常用的有苯扎溴銨和75％乙醇；

第三類消毒劑，專用于無菌操作間，直接用于消毒直接接觸藥品的容器表面，也用于實(shí)驗(yàn)操作過程中的手部消毒和實(shí)驗(yàn)臺(tái)面消毒，常用的有聚維酮碘溶液和75％乙醇。

2.配制

第一類消毒劑的配制方法：不需使用無菌器具，可直接在普通實(shí)驗(yàn)區(qū)按消毒劑使用說明書的配制方法，用純化水稀釋消毒劑的濃溶液后使用。

第二類消毒劑的配制方法：不需使用無菌器具，應(yīng)在更衣室內(nèi)按消毒劑使用說明書的配制方法，用純化水稀釋消毒劑的濃溶液后使用。

第三類消毒劑的配制方法：需要使用無菌器具并在無菌操作間內(nèi)配制。首先取一次性集菌過濾器一個(gè)，將排液口放置在滅菌過的錐形瓶上，將消毒劑濃溶液通過薄膜過濾的方式除菌。然后，按比例取滅菌后的純化水，稀釋濃溶液，制成可供使用的消毒劑。將此消毒劑倒入放置有無菌脫脂棉球的消毒劑缸中，得到可直接使用的消毒劑棉球。（該類消毒劑制備后，應(yīng)收集消毒劑中的微生物）

四、環(huán)境監(jiān)控

（一）目的：

確定工作臺(tái)面、設(shè)備表面的消毒效果和消毒頻次，確定潔凈室的綜合性能以及進(jìn)行維護(hù)的時(shí)機(jī)，確定培養(yǎng)箱的污染情況，判斷是否有必要進(jìn)行徹底消毒。

（二）環(huán)境監(jiān)控的對象

1.樣品貯存的環(huán)境

2.培養(yǎng)基制備的環(huán)境

3.樣品制備和檢驗(yàn)的環(huán)境

4.培養(yǎng)的環(huán)境

（三）環(huán)境監(jiān)控的方法

1.表面微生物數(shù)

• 擦拭法（棉拭子法）
• 淋洗法
• 影印盤法（RODAC法）

2.空氣微生物數(shù)

• 沉降菌法     浮游菌法

浮游菌數(shù)的測定：采用浮游菌測定儀。
沉降菌數(shù)測定：方法：無菌室及凈化工作臺(tái)面消毒擦拭后，打開層流凈化裝置及凈化工作臺(tái)開關(guān)30min，將營養(yǎng)瓊脂平板3個(gè)及玫瑰紅鈉瓊脂平板3個(gè)（直徑9cm），置凈化工作臺(tái)左、中、右各1個(gè)，開蓋暴露30min后將蓋蓋上，分別放在30－35℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48h及25－28℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)72h，細(xì)菌和真菌平均菌落數(shù)小于等于1個(gè)為100級(jí)。實(shí)驗(yàn)室一旦被污染，潔凈度達(dá)不到要求，可以清洗或更換凈化工作臺(tái)過濾器，用甲醛或丙二醇、乳酸熏蒸消毒，方法：在支架上放一個(gè)燒杯（內(nèi)裝少許甲醛，8ml／平方米），下面放一個(gè)裝有少許乙醇的乙醇燈，點(diǎn)燃后，關(guān)閉門窗，乙醇用盡后燈自滅，甲醛蒸氣充滿無菌室，密閉24h。
缺點(diǎn)：甲醛蒸氣易銹蝕儀器，對人有刺激，可用氨水噴霧中和，減少對人眼的刺激。

（四）環(huán)境監(jiān)控的評價(jià)指標(biāo)

1.表面微生物數(shù)

1.1需氧嗜溫菌小于5cfu/cm2，合格

1.2需氧嗜溫菌在5～25cfu/cm2之間，需進(jìn)一步調(diào)查

1.3需氧嗜溫菌大于25cfu/cm2，不合格，應(yīng)立即消毒處理

2.空氣微生物數(shù)

沉降菌大于15cfu/板，應(yīng)暫停工作，進(jìn)行消毒